Characterization of the spatial distribution of lignin in plant cell walls using chemical reporters and Raman spectroscopy
Caractérisation de la distribution spatiale de la lignine dans les parois cellulaires des plantes à l'aide de rapporteurs chimiques et de la spectroscopie Raman
Résumé
Lignin is a polyphenolic polymer of the cell wall involved in many aspects of growth and development in higher plants. As a major component of lignocellulosic biomass, it is also of economic interest. Although the biosynthesis of the lignin polymer is relatively well understood, we need to know more about how changes (quantity/structure) to other cell wall polymers (e.g., cellulose, hemicelluloses, pectins) affect lignin production. To provide more information on this question we implemented a two-phase approach based on the use of biological imaging. The first phase involved the development/improvement of different high- resolution complementary imaging techniques. We firstly developed a novel quantitative ratiometric approach (REPRISAL) based on the parametric/artificial intelligence segmentation of confocal microscopy images obtained by lignin chemical reporter bio-orthogonal chemistry. This methodology allowed us to precisely map the lignification capacity of different cell wall layers (cell corner, compound middle lamella and secondary cell wall) in Arabidopsis WT plants and the prx64 mutant. In a second development, we modified the REPRISAL segmentation algorithim thereby enabling it to be used to map relative cell wall lignin levels determined by the ratiometric safranin-O fluorescence technique. Finally, we used Raman imaging to compare the ability of three different multivariate analytical methods (unmixing, cluster analysis and orthogonal matching) to provide detailed spatial information about the distribution of different polymers in plant cell walls. In the second phase we used the developed/improved imaging techniques to analyse whether changes to cell wall hemicelluloses affect lignification in the Arabidopsis irx9 mutant. Our results demonstrated that changes in the distribution of cell wall hemicelluloses do indeed modify the lignification process, particularly in the younger parts of the plant floral stem. Targeted transcriptomics of selected cell wall genes suggested that the observed changes could be related to the induction of a defence response. Overall, the techniques developed within the framework of this thesis should prove valuable for future studies of cell wall dynamics. The results obtained on the irx9 mutant provide a novel insight into the dynamic relationships that exist between different polymers of the plant cell wall.
La lignine est un polymère polyphénolique de la paroi cellulaire qui est impliqué dans de nombreux aspects de la croissance et du développement des plantes supérieures. En tant que composant majeur de la biomasse lignocellulosique, elle présente également un intérêt économique. Bien que la biosynthèse du polymère de la lignine soit relativement bien comprise, nous avons besoin d'en savoir plus sur la façon dont les changements (quantité/structure) des autres polymères de la paroi cellulaire (par exemple, la cellulose, les hémicelluloses, les pectines) affectent la production de la lignine. Pour obtenir plus d'informations sur cette question, nous avons mis en œuvre une approche en deux phases, basée sur l'utilisation de l'imagerie biologique. La première phase a consisté à développer/améliorer différentes techniques d'imagerie complémentaires à haute résolution. Nous avons tout d'abord développé une nouvelle approche ratiométrique quantitative (REPRISAL) basée sur la segmentation paramétrique/intelligence artificielle d'images de microscopie confocale, obtenues par la chimie bio-orthogonale des rapporteurs chimiques de la lignine. Cette méthodologie nous a permis de cartographier précisément la capacité de lignification des différentes couches de la paroi cellulaire (coin cellulaire, lamelle moyenne composite et paroi secondaire) chez les plantes Arabidopsis WT et le mutant prx64. Dans un deuxième temps, nous avons modifié l'algorithme de segmentation REPRISAL afin de pouvoir l'utiliser pour cartographier les niveaux relatifs de la lignine par la technique de fluorescence ratiométrique de la safranine-O. Enfin, nous avons utilisé l'imagerie Raman pour comparer la capacité de trois méthodes analytiques multivariées différentes (non-mixage, analyse de clusters et orthogonal matching) à fournir des informations détaillées sur la structure de la paroi cellulaire.
Dans la deuxième phase, nous avons utilisé les techniques d'imagerie développées/améliorées pour analyser les modifications des hémicelluloses de la paroi cellulaire affectent la lignification chez le mutant irx9 d'Arabidopsis. Nos résultats ont démontré que les changements dans la distribution des hémicelluloses de la paroi cellulaire modifient effectivement le processus de lignification, en particulier dans les parties les plus jeunes de la hampe florale de la plante. La transcriptomique ciblée de certains gènes de la paroi cellulaire suggère que les changements observés pourraient être liés à l'induction d'une réponse de défense. Globalement, les techniques développées dans le cadre de cette thèse devraient s'avérer précieuses pour les études futures de la dynamique des parois cellulaires. Les résultats obtenus sur le mutant irx9 donnent un nouvel aperçu des relations dynamiques qui existent entre les différents polymères de la paroi cellulaire des plantes.