Etude des interactions moléculaires (affinité / fonctionnalité) d’un récepteur biologique d’intérêt, le RAGE, impliqué dans des pathologies à composante inflammatoire - Université de Lille Accéder directement au contenu
Hdr Année : 2020

Etude des interactions moléculaires (affinité / fonctionnalité) d’un récepteur biologique d’intérêt, le RAGE, impliqué dans des pathologies à composante inflammatoire

Résumé

Uncontrolled and persistent inflammation is a determining factor in the speed of the ageing process and can become the fundamental basis for many chronic diseases, including rheumatoid arthritis (RA), inflammatory bowel disease (IBD), metabolic disorders (diabetes and obesity), cardiovascular disorders (ischemic heart disease, atherosclerosis), neurodegenerative diseases (Parkinson's and Alzheimer's) and cancer. Inflammatory diseases are among the most common causes of chronic disease worldwide. The increasing burden of healthcare costs can be attributed primarily to the severity and complexity of inflammatory disorders. At the same time, a growing number of studies involves RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products), a transmembrane protein of the immunoglobulin-like receptor superfamily, in age-related disorders. The induction of RAGE by its ligands (AGEs, DAMP, HMGB, S100 proteins, etc.) is often associated with pro-inflammatory and pro-oxidative activity. These studies, as well as other results, lead to the hypothesis that RAGE inhibition (gene invalidation or activity antagonism) is capable of preventing and controlling not only acute but also chronic inflammation. The research project I am defending today concerns the development and validation of in vitro models to assess the affinity and functionality of potential antagonists of this receptor. Using an ELISA kit mainly designed to screen for inhibitors of the AGE2 (glyceraldehyde-modified AGE)-RAGE (soluble RAGE) interaction in vitro, I have so far tested 169 molecules, representative of distinct chemical families, from the HEI (Ecole des Hautes Etudes d'Ingénieur) chemical library. This first screening allowed me to identify 15 hits presenting a potential of inhibition of the AGE2-SRAGE interaction comparable, or even better than Azeliragon (reference inhibitor). The cytotoxicity study of these hits on a HEK293 cell model was performed and was negative. In order to study the affinity of these hits for RAGE, the development of HEK-293 cells stably transfected with RAGE Full-length (whole protein), coupled in its C-terminal part with GFP (Green Fluorescent protein), currently allows me to determine in a complementary way, by the technique of Microscale Thermophoresis (MST), the dissociation constants (Kd) of potential RAGE inhibitors. Preliminary results of Kd for 3 hits have been obtained in MST. In parallel, I am developing molecular interaction studies by radiolabeling of a reference compound (tritiated Azeliragon). They will confirm the results obtained in MST and will allow to complete the results by Ki determination (competition studies). The functional study of the different selected Hits will be carried out on HEK-293 cells transfected stably with RAGE Full-Lenght (whole protein), with the negative dominant (without the cytoplasmic part) or the N-terminal binding domain (without the N-terminal binding domain) (under validation in the laboratory). The cells will be stimulated with RAGE ligands (HMGB1, S100A6, S100A12 or CML) in the presence or absence of the selected hits. The measurement of oxidative stress by flow cytometry and the NF-Kb/luciferase reporter gene technique will allow us to identify the bestantagonists of the oxidative and inflammatory pathways mediated by RAGE. These studies will be complemented by the analysis of Akt and Erk expression in western blot and IL-6 and TNF expression in RT-qPCR. In collaboration with other members of the team, once the functionality of the hits is confirmed, they will be tested in a cardiomyocyte model to determine the antagonists that block the cardiomyocyte hypertrophy induced by RAGE activation. We will also use C. Elegans model (expressing human RAGE) to study the in vivo modulation of the controlled and prolonged generation of ROS by RAGE antagonists and its impact on the longevity of the worm. Finally, leads will be evaluated in a mouse model of CML-induced renal aging.
Une inflammation incontrôlée et persistante est un facteur déterminant de la vitesse du processus de vieillissement et peut devenir la base fondamentale de nombreuses pathologies chroniques, notamment la polyarthrite rhumatoïde (PR), les maladies inflammatoires de l'intestin (MII), les troubles métaboliques (diabète et obésité), les troubles cardiovasculaires (cardiopathie ischémique, athérosclérose), les maladies neurodégénératives (Parkinson et Alzheimer) et le cancer. Les maladies inflammatoires sont parmi les causes les plus fréquentes de maladies chroniques dans le monde. La charge croissante des coûts de santé peut être attribuée principalement à la gravité et à la complexité des troubles inflammatoires. Parallèlement, un nombre de plus en plus important d’études implique le RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products), une protéine transmembranaire de la superfamille des récepteurs de type immunoglobuline, dans les troubles liés à l'âge. L'induction du RAGE par ses ligands (AGEs, DAMP, HMGB, protéines S100…) est souvent associée à une activité pro-inflammatoire et pro-oxydante. Ces études, ainsi que d’autres résultats, conduisent à l'hypothèse que l’inhibition du RAGE (invalidation du gène ou antagonisme d’activité) est capable de prévenir et de contrôler non seulement l'inflammation aiguë mais aussi l'inflammation chronique. Le projet de recherche que je défends aujourd’hui concerne le développement et la validation de modèles in vitro afin évaluer l’affinité ainsi que la fonctionnalité d’antagonistes potentiels de ce récepteur. A l’aide d’un kit ELISA principalement conçu pour le criblage des inhibiteurs de l'interaction AGE2 (AGE modifié par le glycéraldéhyde) -RAGE (RAGE soluble) in vitro, j’ai pu tester à ce jour 169 molécules, représentatives de familles chimiques distinctes, issues de la chimiothèque d’HEI (Ecole des hautes Etudes d’Ingénieur). Ce premier screening m’a permis d’identifier 15 hits présentant un potentiel d’inhibition de l’interaction AGE2-sRAGE comparable, voire meilleure que l’Azeliragon (inhibiteur de référence). L’étude de la cytotoxicité de ces hits sur un modèle de cellules HEK293 a été réalisée et s’est révélé négative. Afin d’étudier l’affinité de ces hits pour le RAGE, le développement de cellules HEK-293 transfectées de manière stable avec RAGE Full-length (protéine entière), couplé dans sa partie C-terminale avec la GFP (Green Fluorescent protein), me permet actuellement de déterminer de façon complémentaire, par la technique de Thermophorèse à MicroEchelle (MST), les constantes de dissociation (Kd) des inhibiteurs potentiels de RAGE. Des résultats préliminaires de Kd pour 3 hits ont été obtenus en MST. En parallèle, je développe des études d’interaction moléculaire par radiomarquage d’un composé de référence (Azeliragon tritié). Elles viendront confirmer les résultats obtenus en MST et permettront de compléter les résultats par la détermination de Ki (études de compétition). L’étude fonctionnelle des différents Hits sélectionnés sera effectuée sur des cellules HEK-293 transfectées de manière stable avec RAGE Full-Lenght (protéine entière), avec le dominant négatif (sans la partie cytoplasmique) ou la forme N-tronquée (sans le domaine de liaison N-terminal) (en cours de validation au laboratoire). Les cellules seront stimulées avec des ligands de RAGE (HMGB1, S100A6, S100A12 ou la CML) en présence ou en absence des hits sélectionnés. La mesure du stress oxydant par cytométrie en flux et la technique de gène rapporteur NF-Kb/luciferase nous permettront d’identifier les meilleurs antagonistes des voies oxydantes et inflammatoires médiées par RAGE. Ces études seront complétées par l’analyse des expressions d’Akt et Erk en western blot et de l’IL-6 et du TNF en RT-qPCR. En collaboration avec d’autres membres de l’équipe, une fois la fonctionnalité des hits confirmée, ceux-ci seront testées sur un modèle de cardiomyocytes afin de déterminer les antagonistes qui bloquent l'hypertrophie des cardiomyocytes induite par l’activation du RAGE. Nous utiliserons également le modèle C. Elegans (exprimant le RAGE humain) pour étudier la modulation in vivo de la génération contrôlée et prolongée de ROS par les antagonistes de RAGE et son impact sur la longévité du ver. Enfin, les leads seront évalués sur un modèle murin de vieillissement rénal induit par la CML.
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Citer

Christophe Furman. Etude des interactions moléculaires (affinité / fonctionnalité) d’un récepteur biologique d’intérêt, le RAGE, impliqué dans des pathologies à composante inflammatoire. Sciences du Vivant [q-bio]. ECOLE DOCTORALE BIOLOGIE SANTE, Université de Lille, 2020. ⟨tel-04488669⟩
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